2101程序降溫儀的細(xì)胞凍存操作步驟 2101程序降溫儀簡單來說由程序來控制溫度,慢慢的逐步減低保存溫度,以免減溫速度過快,冰晶刺破凍存樣品(如細(xì)胞、胚胎,降溫過快冰晶容易刺破其細(xì)胞壁),從而使得樣品失效。也稱為程控降溫儀、胚胎冷凍儀等等。主要應(yīng)用在精子、細(xì)胞、胚胎等領(lǐng)域的儲(chǔ)存,以及骨髓、造血干細(xì)胞、皮膚、角膜、內(nèi)分泌腺體、以及血管和瓣膜等的冷凍保存。
2101程序降溫儀進(jìn)行細(xì)胞冷凍保存:
1.材料
生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO、無菌塑料冷凍保存管、0.4%(w/v)trypanblue、血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片、2101程序降溫儀。
2.冷凍保存方法
(1)傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘>-20℃30分鐘>-80℃16-18小時(shí)(或隔夜)>液氮槽長期儲(chǔ)存。-20℃不可超過1小時(shí),以防止胞內(nèi)冰晶過大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降溫:利用已設(shè)定程序的2101程序降溫儀以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽長期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
3.步驟
(1)冷凍前24-48小時(shí)更換半量或全量培養(yǎng)基,使細(xì)胞處于指數(shù)生長期。
(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):另取一離心管,加入培養(yǎng)基、血清,逐滴加入二甲基亞砜(DMSO)至20%濃度,即制成雙倍的凍存液,置于室溫下待用。
(3)離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞,用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞,取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
(4)取與細(xì)胞懸液等量的凍存液,緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液,并晃動(dòng)試管,制成細(xì)胞凍存懸液(DMSO后濃度為5-10%),使細(xì)胞濃度為1-5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中,1-2ml/vial,并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。嚴(yán)密封口后,注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期。然后進(jìn)行凍存。
2101程序降溫儀廣泛用于凍存細(xì)胞、胚胎等。采用微機(jī)控制技術(shù),軟件,能較準(zhǔn)確地控制液氮的施放量,從而保證被凍存的生物制品以適宜的冷凍速率降溫冷凍。操作簡便、人機(jī)界面清楚。